実験の詳細

I マグネティックビーズへの抗体の固定化

Peptide IP assay では、抗体–抗原反応中に抗体がビーズから解離することを防ぐため、抗体はビーズに強固に固定化されている必要がある。IgG 結合タンパク質である Protein A 及び Protein G の抗体への親和性は、動物種とサブクラスによって異なるため、実験者は使用する抗体に高い親和性を示す IgG 結合タンパク質を選択しなくてはならない。例えばマウス由来の抗体には Protein G ビーズが適しており、ラビット由来の抗体には Protein A ビーズが適している。本稿では、Protein A ビーズを用いた実験例を記す（3,4）。

1) ビーズの準備

Protein A Dynabeads をボルテックスミキサーでよく懸濁し、10 μL のビーズを100 μL のPBST/BSA [PBS, 0.5% (W/V) BSA, 0.1% (V/V) Tween20] 溶液に加え、ピペッティングにより攪拌する。マグネティックスタンドを用いてビーズを吸着させ、上清を捨てる。この操作をもう一度繰り返す。

2) ビーズと抗体の混合及び洗浄

1 μg の抗体を100 μL の PBST/BSA 溶液に添加し、ピペッティングまたはタッピングにより攪拌混合することで抗体希釈液を作る。抗体希釈溶液をステップ1で調製したビーズに添加し、4℃にて1時間、ローテーターを用いて攪拌混合する。1ビーズあたりの抗体固定化量が不均一となるため、抗体原液をビーズ懸濁液に直接添加することは避ける。攪拌混合後、マグネティックスタンドを用いてビーズを吸着させ、上清を捨てる。300 μL の PBST/BSA 溶液でビーズを懸濁し、マグネティックスタンドを用いてビーズを吸着させ、上清を捨てる。この操作をもう一度繰り返し、最後に抗体固定化ビーズを100 μL の PBST/BSA 溶液に懸濁する。抗体固定化ビーズは、ヒストンペプチドと混合する直前に PBST/BSA 溶液にて40倍希釈する。

II 抗体–抗原反応

抗体を固定化したビーズとビオチン化ペプチドを混合し、抗体–抗原結合反応を行う。抗原結合反応が平衡に達した後、抗体に未結合のペプチドを洗浄し、蛍光標識ストレプトアビジンを加える。ビーズ上の抗体と相互作用しているビオチン化ペプチドに蛍光標識ストレプトアビジンが結合することで、フローサイトメトリーにより抗体–抗原相互作用に依存した蛍光を検出することが可能となる（図1）。

1) ビオチン化ペプチドの準備

各抗体–抗原反応において、抗体固定化ビーズと等量のビオチン化ペプチドを混合するため、実験者は測定したい濃度の2倍濃いビオチン化ペプチドを準備する。平衡解離定数 K_D を算出するため結合曲線を描きたい場合、複数のデータポイントが必要となるため、実験者はあらかじめ連続希釈した溶液を作製しておく。ペプチド濃度の決定については、「工夫とコツ」を参照すること。希釈液は PBST/BSA である。

2) 抗体固定化ビーズとペプチドの混合及び洗浄

10 μL の希釈した抗体固定化ビーズと10 μL のビオチン化ペプチドを混合する。サンプル数が多い場合は、96well プレートを用いると便利である。抗体の親和性が著しく高く（例えば抗体の K_D 値が picomolar 領域） 、抗原ペプチド濃度を低くする必要がある場合には、抗体固定化ビーズの量を減らす、もしくは反応体積を増やすことで ligand depletion（抗体量に対する抗原量の不足）を防ぐことができる。4℃で30分間振盪させた後、ビーズとペプチドの混合液を96well フィルタープレートに移す。バキュームマニフォールドを用いて溶液を吸引し、300 μL の PBST/BSA を各 well に添加し吸引することで、抗体固定化ビーズを洗浄する。洗浄操作を2回繰り返す。

3) 検出試薬の添加と洗浄

20 μL の10 μg/mL 蛍光標識ストレプトアビジン（著者らは、Streptavidin Dylight650（Thermo）を使用している）を各 well に添加する。4℃で30分間振盪させた後、バキュームマニフォールドを用いて溶液を吸引し、300 μL の PBST/BSA を各 well に添加し吸引することで、抗体固定化ビーズを洗浄する。洗浄操作を2回繰り返す。

III フローサイトメトリーによる蛍光の検出

1) 測定の準備

実験者はまず、ペプチドと反応させていない抗体固定化ビーズをフローサイトメーターに流し、scatter plot にてビーズ集団にゲートをかける。Dynabeads は粒径が均一であるため、scatter plot にてビーズ集団が集約しており、ビーズを判別しやすい。その他、検出感度を調整するためのゲイン値などの設定は、装置によって異なるため、実験者が最適な値を設定する。

2) サンプルの測定

100 μL の PBST/BSA 溶液を用いてビーズを懸濁し、フローサイトメーターに流すことで抗体に結合したペプチドに由来する蛍光を検出する。ゲート内のビーズカウントが、500以上あれば信頼度の高い平均蛍光強度値（MFI: Mean Fluorescence Intensity）を得ることができる。

IV データ解析と平衡解離定数（K_D）値の算出

フローサイトメーターに付属のソフトウエア、もしくは FlowJo などの解析ソフトを用いて、各サンプルの MFI を算出する。抗体の標的ペプチドに対する結合曲線は、ペプチド濃度に対して MFI をプロットすることで描くことができる。平衡解離定数（K_D 値）は、下記の式-1を用い、非線形最小二乗法にてカーブフィッティングを行うことで算出することができる。

\[\mathrm{MFI}(x) = \mathrm{MFI}(0) + \{\mathrm{MFI}(\infty) - \mathrm{MFI}(0)\} \times (\frac{x}{K_D + x}) \tag{式-1}\]

ここで \(x\) はペプチドの濃度、\(\mathrm{MFI}(x)\) はあるペプチド濃度での MFI、\(\mathrm{MFI}(0)\) はペプチドが非存在下（ペプチド濃度が0）での MFI 、\(\mathrm{MFI}(\infty) - \mathrm{MFI}(0)\) は飽和濃度のペプチドを加えたときの \(\mathrm{MFI}\) から \(\mathrm{MFI}(0)\) を差し引いた値である。カーブフィッティングに際しては、K_D 値のみを未知数として扱い、\(\mathrm{MFI}(0)\) 及び \(\mathrm{MFI}(\infty) - \mathrm{MFI}(0)\) は固定値として扱う。非標的ペプチド（Off targets）への平衡解離定数は、\(\mathrm{MFI}(\infty) - \mathrm{MFI}(0)\) がすべての抗原ペプチドで等しくなると仮定してカーブフィッティングを行い、算出する。Peptide IP assay による抗体特異性評価の例として、抗ヒストン H3 トリメチル化 Lys9 抗体について結合評価を行った結果を図2に示す。

工夫とコツ

ビーズの取り扱いについて

ビーズは沈殿しやすく、いずれのステップにおいてもビーズをよく懸濁することが重要である。

ビーズの種類について

本稿では、マグネティックビーズを用いた Peptide IP assay を紹介したが、Protein A や Protein G がコーティングされているポリスチレンビーズを使用することも可能である（3,4）。ポリスチレンビーズを用いる場合、遠心によりビーズを分離する。

非特異吸着の確認

実験者は、抗体を固定化していないビーズとペプチドを混合し、ビーズが抗原ペプチドに非特異吸着しないかを確認する必要がある。著者らは、H4K20me1 ペプチドが Protein A をコーティングしてあるポリスチレンビーズ（Spherotech）に非特異的に吸着することを観測している（3）。

濃度が不明な市販抗体について

ポリクローナル抗体や血清において、抗体濃度が不明な場合がある。その場合、まず1 μL の抗体をビーズに固定化し、測定を行う。MFI が低く、結合曲線が描けない場合、a) ビーズへの抗体固定化量が少ない、b) 抗体自身の結合特性である、可能性がある。原因が前者である場合は、抗体量を増やすことで問題を解決できる。

抗原濃度域の決定について

抗体の標的抗原に対する見かけの平衡解離定数を算出したい場合、K_D 値の濃度を含む抗原濃度域にて結合曲線を描く必要がある。そのため著者らは、まず標的抗原のみを用いて予備実験を行い、抗体の標的抗原に対する K_D 値を見積もることを勧める。予備実験においては、数 μM の抗原を最大濃度として用い、濃度を細かく振る必要は無い。予備実験より得られた結合曲線からおおよその抗体の K_D 値を見積もることができる。

本手法で算出される見かけの平衡解離定数（K_D 値）について

Peptide IP assay においては、a) 抗体と Protein A/G との相互作用、b) 抗体と抗原の相互作用、c) ビオチン化ペプチドと蛍光標識ストレプトアビジンの相互作用、の3つの相互作用が存在する。IgG 結合タンパク質の抗体への結合親和性は、K_D 値が～10^-9 M と高く（7）、加えて avidity 効果（多価効果）により見かけの親和性はさらに高くなる。またストレプトアビジンのビオチンへの結合親和性は K_D 値が～10^-15 M と非常に高い。すなわち、(a) と (c) の相互作用は、(b) 抗体–抗原相互作用と比較して非常に強いため無視でき、本手法で算出される見かけの K_D 値は (b) 抗体–抗原相互作用を反映していると著者らは考えている。

ビオチン化組換え抗体断片の利用

本稿では、IgG 抗体を用いた Peptide IP assay を紹介したが、ビオチン化した組換え抗体断片（Fab など）を用いることも可能である。その場合、ストレプトアビジンがビーズに固定化されている M280 Dynabeads（Thermo）を使用する。詳しくは、文献4を参照すること。

文献

1. Bradbury, A. & Plückthun, A., Nature, 518, 27–9 (2015)
2. Egelhofer, T.A. et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 18, 91–3 (2011)
3. Nishikori, S. et al., J. Mol. Biol., 424, 391–9 (2012)
4. Hattori, T. et al., Nat. Methods, 10, 992–5 (2013)
5. Rothbart, S.B. et al., Mol. Cell, 59, 502–11 (2015)
6. Chao, G. et al., Nat. Protoc., 1, 755–68 (2006)
7. Sidorin, E.V. & Solov’eva, T.F., Biochemistry (Moscow), 76, 295–308 (2011)

実験の詳細

I マグネティックビーズへの抗体の固定化

Peptide IP assay では、抗体–抗原反応中に抗体がビーズから解離することを防ぐため、抗体はビーズに強固に固定化されている必要がある。IgG 結合タンパク質である Protein A 及び Protein G の抗体への親和性は、動物種とサブクラスによって異なるため、実験者は使用する抗体に高い親和性を示す IgG 結合タンパク質を選択しなくてはならない。例えばマウス由来の抗体には Protein G ビーズが適しており、ラビット由来の抗体には Protein A ビーズが適している。本稿では、Protein A ビーズを用いた実験例を記す（3,4）。

1) ビーズの準備

Protein A Dynabeads をボルテックスミキサーでよく懸濁し、10 μL のビーズを100 μL のPBST/BSA [PBS, 0.5% (W/V) BSA, 0.1% (V/V) Tween20] 溶液に加え、ピペッティングにより攪拌する。マグネティックスタンドを用いてビーズを吸着させ、上清を捨てる。この操作をもう一度繰り返す。

2) ビーズと抗体の混合及び洗浄

1 μg の抗体を100 μL の PBST/BSA 溶液に添加し、ピペッティングまたはタッピングにより攪拌混合することで抗体希釈液を作る。抗体希釈溶液をステップ1で調製したビーズに添加し、4℃にて1時間、ローテーターを用いて攪拌混合する。1ビーズあたりの抗体固定化量が不均一となるため、抗体原液をビーズ懸濁液に直接添加することは避ける。攪拌混合後、マグネティックスタンドを用いてビーズを吸着させ、上清を捨てる。300 μL の PBST/BSA 溶液でビーズを懸濁し、マグネティックスタンドを用いてビーズを吸着させ、上清を捨てる。この操作をもう一度繰り返し、最後に抗体固定化ビーズを100 μL の PBST/BSA 溶液に懸濁する。抗体固定化ビーズは、ヒストンペプチドと混合する直前に PBST/BSA 溶液にて40倍希釈する。

II 抗体–抗原反応

抗体を固定化したビーズとビオチン化ペプチドを混合し、抗体–抗原結合反応を行う。抗原結合反応が平衡に達した後、抗体に未結合のペプチドを洗浄し、蛍光標識ストレプトアビジンを加える。ビーズ上の抗体と相互作用しているビオチン化ペプチドに蛍光標識ストレプトアビジンが結合することで、フローサイトメトリーにより抗体–抗原相互作用に依存した蛍光を検出することが可能となる（図1）。

1) ビオチン化ペプチドの準備

各抗体–抗原反応において、抗体固定化ビーズと等量のビオチン化ペプチドを混合するため、実験者は測定したい濃度の2倍濃いビオチン化ペプチドを準備する。平衡解離定数 K_D を算出するため結合曲線を描きたい場合、複数のデータポイントが必要となるため、実験者はあらかじめ連続希釈した溶液を作製しておく。ペプチド濃度の決定については、「工夫とコツ」を参照すること。希釈液は PBST/BSA である。

2) 抗体固定化ビーズとペプチドの混合及び洗浄

10 μL の希釈した抗体固定化ビーズと10 μL のビオチン化ペプチドを混合する。サンプル数が多い場合は、96well プレートを用いると便利である。抗体の親和性が著しく高く（例えば抗体の K_D 値が picomolar 領域） 、抗原ペプチド濃度を低くする必要がある場合には、抗体固定化ビーズの量を減らす、もしくは反応体積を増やすことで ligand depletion（抗体量に対する抗原量の不足）を防ぐことができる。4℃で30分間振盪させた後、ビーズとペプチドの混合液を96well フィルタープレートに移す。バキュームマニフォールドを用いて溶液を吸引し、300 μL の PBST/BSA を各 well に添加し吸引することで、抗体固定化ビーズを洗浄する。洗浄操作を2回繰り返す。

3) 検出試薬の添加と洗浄

20 μL の10 μg/mL 蛍光標識ストレプトアビジン（著者らは、Streptavidin Dylight650（Thermo）を使用している）を各 well に添加する。4℃で30分間振盪させた後、バキュームマニフォールドを用いて溶液を吸引し、300 μL の PBST/BSA を各 well に添加し吸引することで、抗体固定化ビーズを洗浄する。洗浄操作を2回繰り返す。

III フローサイトメトリーによる蛍光の検出

1) 測定の準備

実験者はまず、ペプチドと反応させていない抗体固定化ビーズをフローサイトメーターに流し、scatter plot にてビーズ集団にゲートをかける。Dynabeads は粒径が均一であるため、scatter plot にてビーズ集団が集約しており、ビーズを判別しやすい。その他、検出感度を調整するためのゲイン値などの設定は、装置によって異なるため、実験者が最適な値を設定する。

2) サンプルの測定

100 μL の PBST/BSA 溶液を用いてビーズを懸濁し、フローサイトメーターに流すことで抗体に結合したペプチドに由来する蛍光を検出する。ゲート内のビーズカウントが、500以上あれば信頼度の高い平均蛍光強度値（MFI: Mean Fluorescence Intensity）を得ることができる。

IV データ解析と平衡解離定数（K_D）値の算出

フローサイトメーターに付属のソフトウエア、もしくは FlowJo などの解析ソフトを用いて、各サンプルの MFI を算出する。抗体の標的ペプチドに対する結合曲線は、ペプチド濃度に対して MFI をプロットすることで描くことができる。平衡解離定数（K_D 値）は、下記の式-1を用い、非線形最小二乗法にてカーブフィッティングを行うことで算出することができる。

\[\mathrm{MFI}(x) = \mathrm{MFI}(0) + \{\mathrm{MFI}(\infty) - \mathrm{MFI}(0)\} \times (\frac{x}{K_D + x}) \tag{式-1}\]

ここで \(x\) はペプチドの濃度、\(\mathrm{MFI}(x)\) はあるペプチド濃度での MFI、\(\mathrm{MFI}(0)\) はペプチドが非存在下（ペプチド濃度が0）での MFI 、\(\mathrm{MFI}(\infty) - \mathrm{MFI}(0)\) は飽和濃度のペプチドを加えたときの \(\mathrm{MFI}\) から \(\mathrm{MFI}(0)\) を差し引いた値である。カーブフィッティングに際しては、K_D 値のみを未知数として扱い、\(\mathrm{MFI}(0)\) 及び \(\mathrm{MFI}(\infty) - \mathrm{MFI}(0)\) は固定値として扱う。非標的ペプチド（Off targets）への平衡解離定数は、\(\mathrm{MFI}(\infty) - \mathrm{MFI}(0)\) がすべての抗原ペプチドで等しくなると仮定してカーブフィッティングを行い、算出する。Peptide IP assay による抗体特異性評価の例として、抗ヒストン H3 トリメチル化 Lys9 抗体について結合評価を行った結果を図2に示す。

工夫とコツ

ビーズの取り扱いについて

ビーズは沈殿しやすく、いずれのステップにおいてもビーズをよく懸濁することが重要である。

ビーズの種類について

本稿では、マグネティックビーズを用いた Peptide IP assay を紹介したが、Protein A や Protein G がコーティングされているポリスチレンビーズを使用することも可能である（3,4）。ポリスチレンビーズを用いる場合、遠心によりビーズを分離する。

非特異吸着の確認

実験者は、抗体を固定化していないビーズとペプチドを混合し、ビーズが抗原ペプチドに非特異吸着しないかを確認する必要がある。著者らは、H4K20me1 ペプチドが Protein A をコーティングしてあるポリスチレンビーズ（Spherotech）に非特異的に吸着することを観測している（3）。

濃度が不明な市販抗体について

ポリクローナル抗体や血清において、抗体濃度が不明な場合がある。その場合、まず1 μL の抗体をビーズに固定化し、測定を行う。MFI が低く、結合曲線が描けない場合、a) ビーズへの抗体固定化量が少ない、b) 抗体自身の結合特性である、可能性がある。原因が前者である場合は、抗体量を増やすことで問題を解決できる。

抗原濃度域の決定について

抗体の標的抗原に対する見かけの平衡解離定数を算出したい場合、K_D 値の濃度を含む抗原濃度域にて結合曲線を描く必要がある。そのため著者らは、まず標的抗原のみを用いて予備実験を行い、抗体の標的抗原に対する K_D 値を見積もることを勧める。予備実験においては、数 μM の抗原を最大濃度として用い、濃度を細かく振る必要は無い。予備実験より得られた結合曲線からおおよその抗体の K_D 値を見積もることができる。

本手法で算出される見かけの平衡解離定数（K_D 値）について

Peptide IP assay においては、a) 抗体と Protein A/G との相互作用、b) 抗体と抗原の相互作用、c) ビオチン化ペプチドと蛍光標識ストレプトアビジンの相互作用、の3つの相互作用が存在する。IgG 結合タンパク質の抗体への結合親和性は、K_D 値が～10^-9 M と高く（7）、加えて avidity 効果（多価効果）により見かけの親和性はさらに高くなる。またストレプトアビジンのビオチンへの結合親和性は K_D 値が～10^-15 M と非常に高い。すなわち、(a) と (c) の相互作用は、(b) 抗体–抗原相互作用と比較して非常に強いため無視でき、本手法で算出される見かけの K_D 値は (b) 抗体–抗原相互作用を反映していると著者らは考えている。

ビオチン化組換え抗体断片の利用

本稿では、IgG 抗体を用いた Peptide IP assay を紹介したが、ビオチン化した組換え抗体断片（Fab など）を用いることも可能である。その場合、ストレプトアビジンがビーズに固定化されている M280 Dynabeads（Thermo）を使用する。詳しくは、文献4を参照すること。

文献

1. Bradbury, A. & Plückthun, A., Nature, 518, 27–9 (2015)
2. Egelhofer, T.A. et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 18, 91–3 (2011)
3. Nishikori, S. et al., J. Mol. Biol., 424, 391–9 (2012)
4. Hattori, T. et al., Nat. Methods, 10, 992–5 (2013)
5. Rothbart, S.B. et al., Mol. Cell, 59, 502–11 (2015)
6. Chao, G. et al., Nat. Protoc., 1, 755–68 (2006)
7. Sidorin, E.V. & Solov’eva, T.F., Biochemistry (Moscow), 76, 295–308 (2011)