実験の詳細

第1日目

1) ThT 水溶液の準備

ThT を 100 μM になるように、アルミホイルで遮光したメスフラスコ中で、純水（MQ 水）に溶かす。ThT は溶けにくいので、室温で一晩撹拌する。調製した ThT 水溶液は、遮光し室温で保存する。ThT は、各社から入手できるが、著者らは富士フィルム和光純薬株式会社の製品を使用している。

第2日目

2) Aβ(1-40) ペプチドの調製

Aβ(1-40) ペプチドを 500 μM になるように0.02％アンモニア水溶液に溶かす。筆者らは、ペプチドが入ったバイアルに、冷やしたアンモニア水溶液を加え、丁寧に溶解している。なおアミロイド線維の自発重合を避けるために、ペプチドの調製は全て、低温室で行う。

ペプチドの濃度は、ブラッドフォード法により決定する。濃度を決定した後、1回の実験で使う量ずつ分注し（10 μl あれば数回観察できる）、−80℃で保存する。筆者らは、検量線のスタンダードサンプルとして、別に調製した Aβ(1-40) ペプチドを使っている。検量線は、0，10，25，50，100 μM の吸光度を用いて作成している。なお各濃度に付き、吸光度は3 回ずつ測定し、その平均値を用いる。スタンダートサンプル用の Aβ(1-40) ペプチドは、上記の方法で 100 μM になるように調製し、−80℃で保存している。

また調製した Aβ(1-40) ペプチドの自発重合性を確かめるために、調製した後に ThT 蛍光定量法を行っている。正しく溶解した Aβ(1-40) ペプチドは、1日間重合反応条件下で、インキュベートしても自発重合反応を起こさないが、凝集体を含む Aβ(1-40) ペプチドは、数時間の内に重合反応を起こし、490 nm 付近に ThT 特有の蛍光を示す。

3) ThT 蛍光定量法

ThT蛍光は、分光蛍光光度計を使って測定する。

ThT 蛍光は、分光蛍光光度計を使って測定する。

1. ThT 定量を行う直前に、500 mM グリシン–水酸化ナトリウム緩衝液（pH 8.5）と MQ 水を用いて、5 μM ThT、50 mM グリシン–水酸化ナトリウム緩衝液（pH 8.5）の ThT 溶液をつくる。
2. 5 μl のサンプルを、1 ml のThT 溶液とよく混合し、分光蛍光光度計を用いて蛍光強度を測定する（励起波長：455 nm、蛍光波長：490 nm）。

第3日目

4) Aβ(1-40) アミロイド線維伸長反応

in vitro で Aβ(1-40) アミロイド線維を形成する方法は確立されている。筆者らは、主にシード依存性アミロイド線維伸長反応を観察しているので、まずシードが必要となる。シードとは、超音波処理により断片化したアミロイド線維のことである。

シードの元となるアミロイド線維は、福井大学 内木宏延教授から供与していただいた。Aβ(1-40) アミロイド線維伸長反応は、全て、伸長反応溶液：50 mM リン酸緩衝液（pH 7.5）、100 mM 塩化ナトリウムで行っている。

1. 最終濃度 15 μg/ml になるように、アミロイド線維を伸長反応溶液に懸濁する。懸濁後、マイクロチップを使い、超音波処理を行う。
2. 25 μM Aβ(1-40)、5 μg/ml シードとなるように、伸長反応溶液に混ぜ、37℃の恒温機中で一晩保温する。アミロイド線維伸長の有無は、ThT 蛍光定量法で確認する。
3. 遠心機（15000 × g、4℃、10分間）でアミロイド線維を沈殿させ、50 mM リン酸緩衝液（pH 7.5）、100 mM 塩化ナトリウムで、数度洗う。洗ったアミロイド線維は、ブラッドフォード法で濃度を決定した後、4℃で保存する（筆者らは、200 μg/ml 程度の濃度になるようにしている）。
4. ThT 蛍光測定法を使い、調製した Aβ(1-40) ペプチド及び、シードが、アミロイド線維伸長反応を起こすかどうかを確かめる。筆者らの実験系では、2時間ほどで、平衡に到達する。可能であれば、伸長したアミロイド線維を電子顕微鏡や原子間力顕微鏡で観察し、アミロイド線維特有の形態を示すことを確認する。

5) スライドガラスの洗浄

スライドガラスに付着した汚れや埃は、背景光を生み出す原因となるので、スライドガラスを徹底的に洗浄する。

スライドガラスの保管及び洗浄は、染色バット中で行っている。

1. 0.5％アルカリ性洗剤（Hellmanex Hellma　ナカライテスクから入手可能）中で20分間超音波洗浄する。
2. MQ 水で3回リンスした後、MQ 水中で10分間超音波洗浄する。
3. 再び、MQ 水で10回リンスする。
4. 30％過酸化水素水 20 ml と、28％アンモニア水 1 ml を混ぜ、MQ 水で 100 ml にする。この洗浄液に基板を浸し、70℃の湯浴で10 分間加熱する。70℃に温められた湯浴に、染色バットを浸すと破損するので、湯浴の温度が40℃になったら、浸すとよい。
5. 洗浄液を捨て、MQ 水で10回リンスする。
6. 真空乾燥機を使い、90℃で30分間真空乾燥する。
7. 洗浄したスライドガラスをさらに、UV オゾン洗浄機でさらに洗浄する。洗浄効果は、時間共に低下するので、観察前にUV オゾン洗浄する方がよい。

第4日目以降

6) Aβ(1-40) アミロイド線維の全反射蛍光顕微鏡観察

エッペンドルフチューブ内で伸長した線維を観察できるか確かめる。エッペンドルフチューブ内で伸長したアミロイド線維に、最終濃度が 5 μM になるように ThT 溶液を加える。14 μl をスライドガラス上に載せ、カバーガラスを置いた後、マニキュアで周囲を固める。完成した標本を顕微鏡で観察する。UV オゾン洗浄したスライドガラス表面は、極めて高い親水性を示すので、サンプル量を 20 μl 程度した方が、気泡が入りにくい。

7) スライドガラス表面上で伸長した Aβ(1-40) アミロイド線維の観察

50 μM Aβ(1-40)、5 μg/ml シード、5 μM ThT となるように、伸長反応溶液に混ぜる。14 μl をスライドガラス上に載せ、カバーガラスを置いた後、マニキュアで周囲を固める。いきなりリアルタイム観察を行ってもよいが、何時間かかるか分らない測定を行うのは無駄なので、顕微鏡標本を数枚作り、数時間ごとに観察し、様子を探る。

8) Aβ(1-40)アミロイド線維のリアルタイム観察

2) と同様に、アミロイド線維反応溶液を調製し、37℃に恒温した顕微鏡下で、観察を行う。筆者らは、伸長速度解析等を行う場合は、2分おきに観察を行った。各線維の長さは、解析ソフトウェア（Image-Pro PLUS　Media Cybernetics）を使って求めた。

工夫とコツ

全反射蛍光顕微鏡

筆者らは、プリズム型の全反射蛍光顕微鏡を使っている。プリズム型は、無蛍光グリセロールを使いスライドガラスに密着させたプリズムを介してレーザー光を入射し、スライドガラスとサンプルの界面で全反射を起こす(5)。構成部品のほとんどは、市販されているが、プリズムを装着する部品及びステージの一部は、自作する必要がある。参考までにプリズム周りの様子を示す（図1）。筆者らの顕微鏡は、倒立型蛍光顕微鏡（IX70　オリンパス株式会社）を元に、東北大学 和沢 鉄一博士の協力により作製した。光源は、ヘリウム–カドミウムレーザー（IK5552R-F　金門電気株式会社）を使用し、波長 442 nm の励起光を得る。対物レンズは、油浸対物レンズ（Plan Apo 100×OTIRFM　オリンパス株式会社）を使い、蛍光像は、バンドパスフィルター（D490/30M　Omega Optical）を通った後、CCD カメラ（DP70　オリンパス株式会社）に記録される。顕微鏡は、恒温チャンバー内に置かれており、伸長条件に応じた温度で観察することができる。

観察用カメラの選択

伸長条件にもよるが、アミロイド線維と結合した ThT は強い蛍光を放つ。筆者らの場合、酸性 pH 条件下で伸長する β2 ミクログロブリンアミロイド線維は、肉眼で観察することは不可能だが、中性 pH 条件下で伸長する Aβ(1-40) アミロイド線維は、顕微鏡を通して肉眼で観察できる。肉眼で観察できるようであれば、高価な高感度 CCD カメラでなくとも、通常の顕微鏡用 CCD カメラで十分に観察できる。また最近では、一般用のデジタルカメラの性能がよくなっているので、目的に応じて、これらを代用することもできる。

合成石英スライドガラス

合成石英スライドガラスは、442 nm で励起しても蛍光をほとんど出さないので、個々の線維を観察するのに、適した基板である。ただ合成石英スライドガラスは、一枚1000円程度するので、数を揃えにくい。そこで、最近は、少し大きめのサイズ（26×78×1.0 mm）を注文し、半分に切断して使っている。またホコリやゴミの混入を防ぐために、顕微鏡標本は、クリーンベンチ内で調製している。石英スライドガラスと比較すると、背景光が大きくなるが、通常のガラス製スライドガラスでも、アミロイド線維を一線維レベルで観察することが可能である。またアミロイド線維は、背景光が著しく大きくなるが、通常の蛍光顕微鏡でも観察することができる。ThT を使って、アミロイド線維が観察できるか否かは、全反射蛍光顕微鏡を使わなくても、通常の蛍光顕微鏡とガラス製スライドガラスを使って評価できる。ただし、参考文献(5)にあるように、ガラス製スライドガラスに由来する背景光は、励起波長と観察波長で大きく変化するので、他の蛍光色素を使う際は、注意する必要がある。

対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡を使う際には

筆者の経験では、対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡を用いる時は、カバーガラスの洗浄も必要となる。この時は、磁性染色器（803-131-01　池本理科工業株式会社）を使うと便利である。

文献

1. Ban, T. & Goto, Y., Methods Enzymol., 413, 91–102 (2006)
2. Ban, T et al., J. Biol. Chem., 278, 16462–16465 (2003)
3. Ban, T et al., J. Mol. Biol., 344, 757–767 (2004)
4. Ban, T et al., J. Biol. Chem., 281, 33677–33683 (2006)
5. Wazawa, T & Ueda, M., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 95, 77–106 (2005)

改訂履歴

改訂日	改訂内容	改訂前の PDF
2020-12-28	「所属」を変更。全体に渡って、語彙・文章を適宜修正。	改訂前の PDF

実験の詳細

第1日目

1) ThT 水溶液の準備

ThT を 100 μM になるように、アルミホイルで遮光したメスフラスコ中で、純水（MQ 水）に溶かす。ThT は溶けにくいので、室温で一晩撹拌する。調製した ThT 水溶液は、遮光し室温で保存する。ThT は、各社から入手できるが、著者らは富士フィルム和光純薬株式会社の製品を使用している。

第2日目

2) Aβ(1-40) ペプチドの調製

Aβ(1-40) ペプチドを 500 μM になるように0.02％アンモニア水溶液に溶かす。筆者らは、ペプチドが入ったバイアルに、冷やしたアンモニア水溶液を加え、丁寧に溶解している。なおアミロイド線維の自発重合を避けるために、ペプチドの調製は全て、低温室で行う。

ペプチドの濃度は、ブラッドフォード法により決定する。濃度を決定した後、1回の実験で使う量ずつ分注し（10 μl あれば数回観察できる）、−80℃で保存する。筆者らは、検量線のスタンダードサンプルとして、別に調製した Aβ(1-40) ペプチドを使っている。検量線は、0，10，25，50，100 μM の吸光度を用いて作成している。なお各濃度に付き、吸光度は3 回ずつ測定し、その平均値を用いる。スタンダートサンプル用の Aβ(1-40) ペプチドは、上記の方法で 100 μM になるように調製し、−80℃で保存している。

また調製した Aβ(1-40) ペプチドの自発重合性を確かめるために、調製した後に ThT 蛍光定量法を行っている。正しく溶解した Aβ(1-40) ペプチドは、1日間重合反応条件下で、インキュベートしても自発重合反応を起こさないが、凝集体を含む Aβ(1-40) ペプチドは、数時間の内に重合反応を起こし、490 nm 付近に ThT 特有の蛍光を示す。

3) ThT 蛍光定量法

ThT蛍光は、分光蛍光光度計を使って測定する。

ThT 蛍光は、分光蛍光光度計を使って測定する。

1. ThT 定量を行う直前に、500 mM グリシン–水酸化ナトリウム緩衝液（pH 8.5）と MQ 水を用いて、5 μM ThT、50 mM グリシン–水酸化ナトリウム緩衝液（pH 8.5）の ThT 溶液をつくる。
2. 5 μl のサンプルを、1 ml のThT 溶液とよく混合し、分光蛍光光度計を用いて蛍光強度を測定する（励起波長：455 nm、蛍光波長：490 nm）。

第3日目

4) Aβ(1-40) アミロイド線維伸長反応

in vitro で Aβ(1-40) アミロイド線維を形成する方法は確立されている。筆者らは、主にシード依存性アミロイド線維伸長反応を観察しているので、まずシードが必要となる。シードとは、超音波処理により断片化したアミロイド線維のことである。

シードの元となるアミロイド線維は、福井大学 内木宏延教授から供与していただいた。Aβ(1-40) アミロイド線維伸長反応は、全て、伸長反応溶液：50 mM リン酸緩衝液（pH 7.5）、100 mM 塩化ナトリウムで行っている。

1. 最終濃度 15 μg/ml になるように、アミロイド線維を伸長反応溶液に懸濁する。懸濁後、マイクロチップを使い、超音波処理を行う。
2. 25 μM Aβ(1-40)、5 μg/ml シードとなるように、伸長反応溶液に混ぜ、37℃の恒温機中で一晩保温する。アミロイド線維伸長の有無は、ThT 蛍光定量法で確認する。
3. 遠心機（15000 × g、4℃、10分間）でアミロイド線維を沈殿させ、50 mM リン酸緩衝液（pH 7.5）、100 mM 塩化ナトリウムで、数度洗う。洗ったアミロイド線維は、ブラッドフォード法で濃度を決定した後、4℃で保存する（筆者らは、200 μg/ml 程度の濃度になるようにしている）。
4. ThT 蛍光測定法を使い、調製した Aβ(1-40) ペプチド及び、シードが、アミロイド線維伸長反応を起こすかどうかを確かめる。筆者らの実験系では、2時間ほどで、平衡に到達する。可能であれば、伸長したアミロイド線維を電子顕微鏡や原子間力顕微鏡で観察し、アミロイド線維特有の形態を示すことを確認する。

5) スライドガラスの洗浄

スライドガラスに付着した汚れや埃は、背景光を生み出す原因となるので、スライドガラスを徹底的に洗浄する。

スライドガラスの保管及び洗浄は、染色バット中で行っている。

1. 0.5％アルカリ性洗剤（Hellmanex Hellma　ナカライテスクから入手可能）中で20分間超音波洗浄する。
2. MQ 水で3回リンスした後、MQ 水中で10分間超音波洗浄する。
3. 再び、MQ 水で10回リンスする。
4. 30％過酸化水素水 20 ml と、28％アンモニア水 1 ml を混ぜ、MQ 水で 100 ml にする。この洗浄液に基板を浸し、70℃の湯浴で10 分間加熱する。70℃に温められた湯浴に、染色バットを浸すと破損するので、湯浴の温度が40℃になったら、浸すとよい。
5. 洗浄液を捨て、MQ 水で10回リンスする。
6. 真空乾燥機を使い、90℃で30分間真空乾燥する。
7. 洗浄したスライドガラスをさらに、UV オゾン洗浄機でさらに洗浄する。洗浄効果は、時間共に低下するので、観察前にUV オゾン洗浄する方がよい。

第4日目以降

6) Aβ(1-40) アミロイド線維の全反射蛍光顕微鏡観察

エッペンドルフチューブ内で伸長した線維を観察できるか確かめる。エッペンドルフチューブ内で伸長したアミロイド線維に、最終濃度が 5 μM になるように ThT 溶液を加える。14 μl をスライドガラス上に載せ、カバーガラスを置いた後、マニキュアで周囲を固める。完成した標本を顕微鏡で観察する。UV オゾン洗浄したスライドガラス表面は、極めて高い親水性を示すので、サンプル量を 20 μl 程度した方が、気泡が入りにくい。

7) スライドガラス表面上で伸長した Aβ(1-40) アミロイド線維の観察

50 μM Aβ(1-40)、5 μg/ml シード、5 μM ThT となるように、伸長反応溶液に混ぜる。14 μl をスライドガラス上に載せ、カバーガラスを置いた後、マニキュアで周囲を固める。いきなりリアルタイム観察を行ってもよいが、何時間かかるか分らない測定を行うのは無駄なので、顕微鏡標本を数枚作り、数時間ごとに観察し、様子を探る。

8) Aβ(1-40)アミロイド線維のリアルタイム観察

2) と同様に、アミロイド線維反応溶液を調製し、37℃に恒温した顕微鏡下で、観察を行う。筆者らは、伸長速度解析等を行う場合は、2分おきに観察を行った。各線維の長さは、解析ソフトウェア（Image-Pro PLUS　Media Cybernetics）を使って求めた。

工夫とコツ

全反射蛍光顕微鏡

筆者らは、プリズム型の全反射蛍光顕微鏡を使っている。プリズム型は、無蛍光グリセロールを使いスライドガラスに密着させたプリズムを介してレーザー光を入射し、スライドガラスとサンプルの界面で全反射を起こす(5)。構成部品のほとんどは、市販されているが、プリズムを装着する部品及びステージの一部は、自作する必要がある。参考までにプリズム周りの様子を示す（図1）。筆者らの顕微鏡は、倒立型蛍光顕微鏡（IX70　オリンパス株式会社）を元に、東北大学 和沢 鉄一博士の協力により作製した。光源は、ヘリウム–カドミウムレーザー（IK5552R-F　金門電気株式会社）を使用し、波長 442 nm の励起光を得る。対物レンズは、油浸対物レンズ（Plan Apo 100×OTIRFM　オリンパス株式会社）を使い、蛍光像は、バンドパスフィルター（D490/30M　Omega Optical）を通った後、CCD カメラ（DP70　オリンパス株式会社）に記録される。顕微鏡は、恒温チャンバー内に置かれており、伸長条件に応じた温度で観察することができる。

観察用カメラの選択

伸長条件にもよるが、アミロイド線維と結合した ThT は強い蛍光を放つ。筆者らの場合、酸性 pH 条件下で伸長する β2 ミクログロブリンアミロイド線維は、肉眼で観察することは不可能だが、中性 pH 条件下で伸長する Aβ(1-40) アミロイド線維は、顕微鏡を通して肉眼で観察できる。肉眼で観察できるようであれば、高価な高感度 CCD カメラでなくとも、通常の顕微鏡用 CCD カメラで十分に観察できる。また最近では、一般用のデジタルカメラの性能がよくなっているので、目的に応じて、これらを代用することもできる。

合成石英スライドガラス

合成石英スライドガラスは、442 nm で励起しても蛍光をほとんど出さないので、個々の線維を観察するのに、適した基板である。ただ合成石英スライドガラスは、一枚1000円程度するので、数を揃えにくい。そこで、最近は、少し大きめのサイズ（26×78×1.0 mm）を注文し、半分に切断して使っている。またホコリやゴミの混入を防ぐために、顕微鏡標本は、クリーンベンチ内で調製している。石英スライドガラスと比較すると、背景光が大きくなるが、通常のガラス製スライドガラスでも、アミロイド線維を一線維レベルで観察することが可能である。またアミロイド線維は、背景光が著しく大きくなるが、通常の蛍光顕微鏡でも観察することができる。ThT を使って、アミロイド線維が観察できるか否かは、全反射蛍光顕微鏡を使わなくても、通常の蛍光顕微鏡とガラス製スライドガラスを使って評価できる。ただし、参考文献(5)にあるように、ガラス製スライドガラスに由来する背景光は、励起波長と観察波長で大きく変化するので、他の蛍光色素を使う際は、注意する必要がある。

対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡を使う際には

筆者の経験では、対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡を用いる時は、カバーガラスの洗浄も必要となる。この時は、磁性染色器（803-131-01　池本理科工業株式会社）を使うと便利である。

文献

1. Ban, T. & Goto, Y., Methods Enzymol., 413, 91–102 (2006)
2. Ban, T et al., J. Biol. Chem., 278, 16462–16465 (2003)
3. Ban, T et al., J. Mol. Biol., 344, 757–767 (2004)
4. Ban, T et al., J. Biol. Chem., 281, 33677–33683 (2006)
5. Wazawa, T & Ueda, M., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 95, 77–106 (2005)

改訂履歴

改訂日	改訂内容	改訂前の PDF
2020-12-28	「所属」を変更。全体に渡って、語彙・文章を適宜修正。	改訂前の PDF